黑斑蛙属两栖纲无尾目蛙科侧褶蛙属，又称黑斑侧褶蛙、青蛙，在我国广泛散布于除海南、云南、西藏、青海和台湾以外的各地区。黑斑蛙有低脂肪、低胆固醇、高蛋白的长处，有较高的食用和药用价值，是我国近年来饲养蛙类中的首要种类之一。其饲养具有投入少、产出高、周期短、效益高级特色，近年来我国黑斑蛙饲养业展开非常迅猛。但是，跟着黑斑蛙人工饲养规划的扩展，饲养环境呈现恶化，加之不成熟的饲养技能，黑斑蛙的病害也逐年增多，给饲养户构成巨大经济损失。现在，已有致病性洛菲不动杆菌、嗜水气单胞菌、气单胞菌、肺炎克雷伯菌、米尔伊丽莎白菌、脑膜炎脓毒黄杆菌和脑膜败血伊丽莎白菌等感染黑斑蛙后导致其严峻逝世的报导。

　　蛙歪头病，因蛙发病时颈部歪斜而得名，该病传染性强，逝世率高，现在尚无安稳有用的医治办法，是蛙饲养过程中常见的疾病之一。2019年7月，湖北石首市大垸农场饲养黑斑蛙大面积逝世，病蛙呈现典型的头部变歪、单侧或许双侧眼球污浊发白和腹水症状，发病温度为25～28 ℃，发病率达80%，逝世率高达90%。对病蛙脑、肝、脾和肾脏进行病原菌别离，并经过病原菌的形状特征、生理生化特性、16S rRNA基因测序与系统发育对别离菌株进行断定，承认该病原菌的种属位置；然后经过人工感染实验和安排病理学剖析承认该病原菌的致病性；终究经过药物灵敏实验剖析该病原菌的药物灵敏性，以期为该病的临床防治用药供给科学辅导和理论支撑。

　　患病黑斑蛙取自湖北省石首大垸农场，收集患有歪头、单侧或许双侧眼球污浊发白和腹水症状的黑斑蛙，共20只，均匀体重为(48.0±1.0)g；健康黑斑蛙购自荆州市枣林铺黑斑蛙饲养基地，均匀体重为(50.0±1.0)g，共140只，暂养于长江大学动科学院用于后续攻毒实验。

　　LB固体和液体培育基购自青岛海博有限公司，革兰氏染色液和苏木精伊红染色液购自北京索莱宝科技有限公司，API 20E试剂盒购自法国梅里埃生化公司，甲醛、二甲苯、无水乙醇和固体白腊等购自国药集团化学试剂有限公司，药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，Taq酶、dNTPs、细菌基因组提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司，PCR扩增引物组成和扩增产品的测序均由武汉擎科立异生物科技有限公司完结。

　　光学显微镜购自奥林巴斯，PCR仪器购自SensoQuest，生物安排白腊包埋机购自湖北安立信医疗实业有限公司，白腊切片机购自德国徕卡。

　　无菌条件下从病蛙脑、肝、脾和肾等部位，用无菌接种环取样后划线接种于LB固体培育基，28 ℃培育24h，次日挑取平板上优势菌落，LB固体培育基纯化培育24h，取单菌落培育后4 ℃保存备用。从脑、肝、脾和肾四种安排中均别离到菌落形状相同的优势菌，选取脑安排中别离菌株为研讨目标，暂命名为BSH3。

　　将BSH3菌株划线接种于LB固体培育基上，置于28 ℃恒温培育箱中培育24h，调查细菌菌落形状特征与色彩，丈量菌落直径巨细。挑选单菌落用革兰氏染色液进行革兰氏染色后，显微镜调查细菌染色特征。

　　菌株BSH3的生理生化目标运用API 20E试剂盒进行检测，操作办法详见该试剂盒阐明书，经过APIweb断定软件判读实验成果，并参照伯杰氏细菌断定手册中细菌生理生化目标进行承认。

　　取天然发病黑斑蛙的脑、肝、脾和肾安排(0.5cm×0.5cm×0.2cm)，置于4%多聚甲醛固定液中固定48h后，进行惯例白腊切片和HE染色，Olympus显微镜下调查安排病理变化。

　　健康黑斑蛙实验前在50cm×40cm×30cm的塑料筐中暂养2周，每框20只，共7框。框中参加曝气水使其淹过黑斑蛙背部，并放入一块泡沫板。暂养和实验期间水温保持在25～28 ℃，定时换水。暂养前进行抽样检测，承认实验用蛙不带着病原菌。

　　将别离纯化的菌株BSH3接种于LB液体培育基28 ℃振动培育24h后，8000离心10min堆积菌体，去上清后用无菌PBS稀释成浓度为1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL的菌液。将黑斑蛙随机分为6个感染组和1个阴性对照组，每组20只。选用大腿打针法进行人工感染，实验组每只打针0.2mL不同浓度菌悬液，对照组打针等体积的PBS。接连调查8d，每日早上9点和下午5点记载实验蛙的临床症状及逝世状况，并将刚逝世蛙的脑安排再次进行细菌别离与断定。选用寇氏法核算菌株BSH3的半致死浓度(LC)。

　　选用纸片琼脂分散法检测菌株BSH3药物灵敏性。首先将BSH3菌株接种于LB液体培育基，28 ℃振动培育24 h后，8000离心10min堆积菌体，用无菌PBS稀释菌体至0.5个麦氏浓度，取20μL菌悬液均匀涂布于LB固体平板上，待菌液被吸收后，向培育基贴不同抗生素药敏纸片，置于28 ℃恒温培育箱中倒置培育24h，丈量抑菌圈直径，并参照产品阐明书判别规范来断定成果。按相同办法每种药敏纸片重复3次。

　　患病蛙的头部呈现向一侧严峻歪斜的症状(图1a)，有些病蛙不只具有歪头症状一起也呈现了单侧或许双侧眼球污浊发白的症状(图1b、c)，别的部分病蛙呈现腹部胀大的症状(图1d)，解剖发现蛙腹内有很多浅黄色腹水，肝脏充血肿大呈黄红相间的花斑肝(图e)，病蛙肠道内无食物，充溢通明状液体(图f)。

　　BSH3菌株在LB平板上28 ℃培育24h后，可构成灰白色、圆形至椭圆形不等、中心微凸起、外表润滑、边际规整，直径在1～2mm的小菌落(图2a)。革兰氏染色为革兰氏阴性短杆菌，长1.0～2.0μm，宽0.5～0.8μm(图2b)。

　　经过PCR扩增和克隆测序取得BSH3菌株的16S rRNA基因片段长度约为1500bp。将菌株基因序列在NCBI上进行BLAST在线比照，成果显现，菌株BSH3与米尔伊丽莎白菌16S rRNA基因序列(登录号：KY930330.1)的同源性达99.93%。下载GenBank中相关细菌16S rRNA基因序列，经过Clustal X软件进行多重比对，用MEGA6.0软件中邻接法(neighbor joining，NJ)构建分子系统发育树(图3)。成果显现，菌株BSH3与米尔伊丽莎白菌处于一个进化分支上。

　　生理生化成果显现菌株BSH3能够运用脲素、Kohn明胶、山梨醇、麦芽糖、乳糖、葡萄糖和甘露醇，不能运用邻硝基苯-半乳糖苷、赖氨酸、鸟氨酸、柠檬酸钠、硫代硫酸钠、色氨酸、丙酮酸盐、肌醇、鼠李糖、蔗糖、蜜二糖、苦杏仁苷、阿拉伯糖和木糖(表1)。

　　患病黑斑蛙肝脏安排呈现很多褐素堆积，发生空泡变性和纤维素样变性(图4a)；肾小管和肾小囊呈现玻璃样变形，有很多炎性细胞滋润和出血现象(图4b)；脾脏安排中发生空泡变性和玻璃样变形，并伴有炎性细胞滋润(图4c)；脑基质水肿，胶质细胞增多，神经元细胞、胶质细胞周围空地变大，基质中存在空泡，伴有出血现象(图4d)。

　　菌株BSH3人工感染黑斑蛙后，蛙体呈现不摄食，歪头、白内障、失掉定向运动才能等神经性损害症状。菌株浓度为1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10、1.0×10CFU/mL时，黑斑蛙的累计逝世率分别为100%、95%、85%、65%和25%。而打针浓度为1.0×10CFU/mL或PBS时，黑斑蛙在实验期间没有呈现逝世。对病死蛙脑、肝、脾和肾等安排进一步进行细菌别离断定，经断定为米尔伊丽莎白菌，与天然患病蛙细菌别离断定成果共同，标明米尔伊丽莎白菌是构成此次黑斑蛙歪头病的病原菌。选用寇氏法核算该菌株对黑斑蛙的半数致死量(LC)为6.3×10CFU/mL(表2)。

　　菌株BSH3对23种抗菌药物的药敏实验成果见表3，成果标明别离菌株对米诺环素、氟苯尼考、利福平和万古霉素灵敏，对氧哌嗪青霉素、羧苄西林、多西环素、复方新诺明、恩洛沙星和萘啶酸中度灵敏，对青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢氨苄、头孢他啶、头孢克洛、氨曲南、吡哌酸、庆大霉素、链霉素、卡那霉素、丁胺卡那、新霉素和多粘菌素B等多种药物耐药。

　　歪头病是蛙类饲养过程中损害较大的疾病之一，一般还伴有白内障、腹水等并发症。不同患病个别体现出来的详细症状也有所不同，急性患病个别只体现出歪头症状，不体现白内障和腹水等症状；而在缓慢患病个别中，歪头、白内障和腹水三种症状均可体现出来。导致病蛙呈现急性和缓慢感染的首要原因是细菌感染的部位不同，在急性歪头病蛙中只能从脑部别离到很多病菌，而在呈现三种症状的缓慢病蛙能够一起从眼、脑、肝、肾和腹水等部位别离到相同致病菌。本实验中，患病黑斑蛙临床特征首要体现为胃口减退，歪头，白内障和腹水等，这与Hu等报导的米尔伊丽莎白菌引起黑斑蛙歪头病的成果共同。其间，歪头和白内障具有代表性，能够作为临床上确诊该病的重要依据。

　　在鱼类和蛙饲养过程中均有白内障病的报导，但引起两者呈现白内障的病原存在差异。引起鱼类眼球外表呈现白内障的病原为寄生虫，如复口吸虫的尾蚴和囊蚴等能够引起鱼类白内障病。现在，已报导的棘胸蛙、青蛙、黑斑蛙、棘腹蛙、牛蛙、虎纹蛙、刺蛙等蛙类白内障(歪头)则均是由细菌引起。其间，首要是由伊丽莎白菌属(spp.)的脑膜败血伊丽莎白菌()所引起。

　　米尔伊丽莎白菌为革兰氏阴性杆菌，隶属于黄杆菌科伊丽莎白菌属，广泛散布于淡水和土壤中。2003年该菌初次从平和空间站冷凝水中被别离到。尔后，研讨发现该菌可引起人类腹膜炎、肺炎、脑膜炎、蜂窝安排炎、败血症和眼部感染等症状。米尔伊丽莎白菌可感染多种无尾类动物，在黑斑蛙、刺蛙、豹蛙、树蛙和微蹼铃蟾等中均有发现，呈现歪头、白内障和腹水等症状，并导致很多患病逝世。本研讨中，人工回归感染实验标明米尔伊丽莎白菌BSH3的半数致死量为6.3 × 10CFU/mL，具有较强的致病性。但是，Huang等研讨中，米尔伊丽莎白菌的致死率相对偏低，阐明不同别离株的致病力存在差异。

　　实验对患病蛙脑、肝、脾和肾脏进行安排病理调查，发现米尔伊丽莎白菌感染黑斑蛙后可引起蛙这些安排损害。尤其是蛙脑基质轻度水肿，胶质细胞显着增多，胶质细胞、神经元细胞周围空地增大，基质中有空泡。这与伊丽莎白菌引起蛙类脑部病理调查成果是共同的。当蛙体质下降并遭到病原损害时，病原躲过了蛙体的免疫防护，在蛙体内定植并不断繁衍，沿着某种途径侵入大脑，构成大脑的各类炎症和机能妨碍，呈现了歪头、旋游、定向才能失调的症状。别的，病蛙肝、脾和肾脏呈现变性、坏死和炎症细胞滋润等病变。由此可见，患病的黑斑蛙病灶并不只仅局限于脑部，其他内脏器官也不同程度遭到感染且愈加严峻，多器官坏死、衰竭终究加快了病蛙的逝世。本实验中从病蛙的脑、肝、脾、肾安排中均别离到致病菌株，暗示病原菌是导致蛙安排损害的原因。胡瑞雪从患病蛙脑安排别离到一株米尔伊丽莎白菌FL160902，该菌可引起蛙肝、脾、肾、脑不同程度的损害，其间以脑部病变最为显着。此外，秦振阳从湖南岳阳发生歪头病的黑斑蛙脑部、眼球、肝脏、卵巢等多处安排器官别离到一株米尔伊丽莎白菌别离株HNW1681，能够引起蛙心脏、肝脏、脑、眼等不同程度的病理变化。这些研讨标明米尔伊丽莎白菌对黑斑蛙的感染是呈全身性的，并且引起蛙全身性安排损害。

　　本实验药敏实验成果显现，米尔伊丽莎白菌BSH3仅对米诺环素、氟苯尼考、利福平和万古霉素四种药物灵敏。但是，利福平和万古霉素这两种药在水产上是禁用药，所以在黑斑蛙患歪头病时应制止运用。米诺环素和氟苯尼考是农业部同意运用的水产药物，生产中可用盐酸米诺环素粉剂100g拌料1000kg，连用5～7d或每kg体重拌饲投喂15～20mg氟苯尼考粉，每天一次，连用3～5d。但过度运用米诺环素易使水体污染和对水生生物发生毒性作用，因而生产中尽量不运用米诺环素医治黑斑蛙歪头病。吴兴镇发现五味子、柯子、半枝莲、五倍子，乌梅等植物性药物在操控伊丽莎白菌感染时起到了杰出的作用，加强植物性药物的研制与运用可能是将来有用防治伊丽莎白菌病的重要途径。此外，米尔伊丽莎白菌能够损害蛙的神经器官，比方大脑，能够在细胞间基质外生计，乃至少量细菌能够进入细胞质。在医治该病时，能够考虑运用一些更简单穿透血脑屏障的脂溶性药物，如磺胺类药物。周永灿等研讨发现脑膜炎败血伊丽莎白菌全菌疫苗能够在必定程度上防备虎纹蛙白内障疾病的发生，这为运用免疫学办法防控伊丽莎白菌病供给了理论依据与数据支撑。

　　在水产饲养过程中需求选用“以防为主，防治结合”的归纳防治办法。抗生素的长期运用会导致细菌耐药性的发生和水体环境的污染。使用疫苗展开疾病的免疫防治不只能够进步动物本身的免疫水平、增强机体的抗病才能，并且还契合绿色环保的要求，将是水生动物疾病防治的干流展开方向。

　　本研讨经过形状学、生理生化特性剖析与分子生物学相结合的办法，从患歪头病黑斑蛙体内别离到致病菌株米尔伊丽莎白菌，命名为BSH3。病理安排调查米尔伊丽莎白菌能够引起黑斑蛙全身性安排病理损害。经过药物灵敏实验，开始筛选出氟苯尼考可用于黑斑蛙歪头病的防控。

　　(作者：李川北，阮陈松杰，吴明波，徐洪森，苏应兵。长江大学动物科学学院，武汉轻工大学动物科学与养分工程学院)