白芍 Paeoniae Radix Alba 作为大宗中药种类，始载于《神农本草经》，其味苦、酸，性微寒，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳等成效 [1] 。 由于白芍“酸寒伐生发之气”，易使寒症加剧，故脾胃虚寒、血虚兼凝血者不宜服用，因而，在临床使用中一般需经过酒炒、清炒、土炒等编造办法改动或平缓其酸寒药性，其间酒炙白芍，可借酒温升散寒，下降其酸寒伐肝之性，在《本草纲目》中有记载：“芍药……性味酸寒，冬月必以酒炒，凡腹痛多是血脉凝涩，亦必酒炒用” [2] 。现代研讨亦标明，酒白芍与其他编造品在临床成效以及药理效果上与白芍生品比较均有所差异 [3-4] ，标明其编造前后的化学成分也有所不同。

　　现在，对白芍的研讨多会集在不同的加工办法与药材质量之间的联络 [5-6] ，以及产地不同的药材其质量的彼此比较等方面 [7] ，关于其酒炙前后化学成分与成效改变等相关研讨不充分，不利于白芍酒炙前后的区别以及其临床上用药质量的操控。依据此，本试验以生白芍与酒白芍饮片为研讨目标，树立 HPLC 指纹图谱，结合化学计量学对白芍酒炙前后进行区别，挑选酒炙前后首要差异性标志物，并进行定量剖析，对白芍酒炙前后的化学成分改变进行开始研讨，然后为后续白芍酒炙编造机制、质量操控，以及其在临床上使用等方面的研讨供给参阅。

　　EX125DZH 型万分之一电子天平，美国奥豪斯仪器有限公司； EX-H3052 型百万分之一微量剖析天平，上海赞维衡器有限公司； Thermo Fisher Ulti Mate3000 高效液相色谱仪， LPG-3400SDN 四元泵， DAD-3000 检测器，赛默飞世尔科技（我国）有限公司； JK-300DB 型超声波清洗器，合肥金尼克机械制造有限公司。

　　10 批生白芍饮片经安徽中医药大学俞年军教授判定，均为毛茛科芍药属植物芍药 Paeonia lactiflora Pall. 的枯燥根加工编造品，部分酒白芍饮片参阅《我国药典》 2020 年版 [1] 由试验室自行编造，含水量均小于 14% ，契合《我国药典》 2020 年版规则，样品信息详见表 1 ，编号 B1 ～ B10 为生白芍饮片，编号 J1 ～ J10 为酒白芍饮片。其间 B1 编造为 J3 、 J4 ， B2 编造为 J5 ， B3 编造为 J6 ， B4 编造为 J7 ， B5 编造为 J8 、 J9 ， B7 编造为 J10 ，其他饮片均为购买所得。

　　乙腈和甲醇为色谱纯，购于美国 Tedia 公司；水为娃哈哈纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为剖析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

　　2.1.1 对照品溶液 精细称取对照品 没食子酸、氧化芍药苷、芍药内酯苷、芍药苷、没食子酰芍药苷、 1,2,3,4,6-O- 五没食子酰基葡萄糖 和苯甲酰芍药苷 适量，置于 10 mL 量瓶中，加 70% 甲醇溶解并定容至刻度，得每 1 mL 含 没食子酸 50.2 μg 、氧化芍药苷 107.2 μg 、芍药内酯苷 105.8 μg 、芍药苷 100.6 μg 、没食子酰芍药苷 100.4 μg 、 1,2,3,4,6-O- 五没食子酰基葡萄糖 120 μg 、苯甲酰芍药苷 107.4 μg 的混合对照品溶液。

　　2.1.2 供试品溶液 [8] 精细称定各批次生、酒白芍饮片样品粉末（过四号筛） 0.1 g ，置 50 mL 量瓶中，加稀乙醇 35 mL ，超声处理（功率 240 W 、频率 45 kHz ） 30 min ，放冷，加稀乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

　　2.3.1 精细度试验 取生白芍饮片样品（ B1 ），依照“ 2.1.2 ”项下办法制备供试品溶液，按“ 2.2 ”项下色谱条件接连进样 6 次，记载色谱图，以芍药苷（峰 7 ）为参照峰，核算各共有峰相对保存时刻 RSD 为 0.01% ～ 0.06% ，相对峰面积 RSD 为 1.01% ～ 2.73% ，标明仪器精细度杰出。

　　2.3.2安稳性试验 取生白芍饮片样品（ B1 ），依照“ 2.1.2 ”项下办法制备供试品溶液，别离于 0 、 2 、 4 、 8 、 12 、 24 h 进样，记载色谱图，以芍药苷（峰 7 ）为参照峰，核算各共有峰相对保存时刻 RSD 为 0.01% ～ 0.06% ，相对峰面积 RSD 为 1.27% ～ 2.29% ，标明供试品溶液在 24 h 内安稳性杰出。

　　2.3.3重复性试验 取生白芍饮片样品（ B1 ） 6 份，依照“ 2.1.2 ”项下办法制备供试品溶液，按“ 2.2 ”项下色谱条件进样，记载色谱图，以芍药苷（峰 7 ）为参照峰，核算各共有峰相对保存时刻 RSD 为 0.01% ～ 0.08% ，相对峰面积 RSD 为 0.59% ～ 2.79% ，标明此办法重复性杰出。

　　2.3. 4 指纹图谱的树立及共有峰的标定 别离将 10 批生白芍（ B1 ～ B10 ）、酒白芍（ J1 ～ J10 ）饮片，以“ 2.1.2 ”项下的过程装备为待测样品，进行检测，将得到的各样品图谱别离导入《中药色谱指纹图谱类似度点评复古》（ 2012 年版）软件进行图谱剖析。别离以 B1 和 J1 作为参照图谱，选用“中位数法”，时刻宽度设定为 0.1 min ，进行多点校正和全谱峰匹配，生成对照色谱图（ R ），终究别离树立生、酒白芍饮片样品指纹图谱。其间 10 批生白芍与酒白芍指纹图谱中均标定 10 个首要共有峰（首要共有峰的总面积均占样品总峰面积的 80% 以上），成果如图 2 所示。

　　一起再运用类似度点评软件，将白芍酒炙前后一切批次饮片样品（ B1 ～ J10 ）色谱图导入其间，核算其类似度别离为 0.998 、 0.998 、 0.997 、 0.999 、 0.998 、 0.996 、 0.999 、 0.999 、 0.999 、 0.999 、 0.999 、 0.997 、 0.998 、 0.998 、 0.998 、 0.999 、 0.999 、 0.998 、 0.992 、 0.999 ，均大于 0.9 ，标明白芍酒炙前后其二者各自指纹图谱类似性较好，但并不能体现出白芍酒炙前后的区别性及质量差异，无法有用区别生白芍饮片和酒白芍饮片。由于指纹图谱中首要峰群的全体类似，因而需求进一步剖析其共有峰以及选用化学计量学剖析其差异与首要差异性标志物。

　　2.3. 6 生白芍与酒白芍指纹图谱共有峰的差异性剖析 经过与混合对照品色谱图中各色谱峰保存时刻进行比对，指认出世白芍与酒白芍指纹图谱中的 7 个共有峰，别离为峰 1 （没食子酸）、 2 （氧化芍药苷）、 6 （芍药内酯苷）、 7 （芍药苷）、 8 （没食子酰芍药苷）、 9 （ 1,2,3,4,6-O- 五没食子酰葡萄糖）、 10 （苯甲酰芍药苷）。 生白芍与酒白芍饮片指纹图谱有峰的相对峰面积见表 2 ，所得成果选用 SPSS 24.0 软件进行独立样本 t 查验，并运用 GraphPad Prism 8 软件，制作小提琴图（ violin plot ，图 3 ），可直观形象地调查和比照出白芍饮片酒炙前后 10 个共有峰的峰面积改变。由图 3 成果可得，白芍酒炙后峰 1 与峰 9 的峰面积出现出不同程度地添加趋势，且峰 1 具有显著性改变差异；其他峰的峰面积 出现出不同程度地削减趋势，其间峰 2 ～ 4 、 7 、 8 、 10 具有显著性改变差异。

　　2.4.1 层次聚类剖析（hierarchical cluster analysis ，HCA ）白芍饮片酒炙前后的差异[11-12] 选用SIMCA 14.1 对一切样品10 个共有峰相对峰面积为变量，进行HCA ，所得成果如图4 所示。当聚类间隔为20 ～25 时，20 批样品可显着聚为生白芍及酒白芍2 类，其间B1 ～B10 为一类，J1 ～J10 为一类，HCA 成果标明，白芍酒炙前后可显着分为2 类，其成分含量存在必定差异，而在其间生白芍与酒白芍各自不同批次之间又存在必定差异，其原因或许与饮片药材搜集的原产地、采收时刻以及其编造工艺存在必定的差异。

　　2.4.2 主成分剖析（ principal component analysis ， PCA ）白芍饮片酒炙前后的差异 [13-14] 选用 SPSS 24.0 和SIMCA 14.1 核算软件，以上述B1 ～J10 白芍酒炙前后样品10 个共有峰相对峰面积为变量，进行PCA ，得B5 批次样品剖析成果在置信区间之外，故PCA 暂将B5 样品除掉不作剖析。其他样品剖析后可得抽样合适性查验（Kaiser Meyer Olkin ，KMO ，查验值≥0.6 ）和巴特利特球形查验（Bartlett ，查验值≤0.05 ），标明本研讨所得成果能够用于进行PCA ；其主成分特征值和贡献率，以及主成分矩阵所得成果如表3 、4 所示。

　　由表3 可得，特征值大于1 时，可得出主成分3 个，累积方差贡献率为72.930% ，阐明这3 个主成分能够客观的反映生白芍和酒炙白芍与10 个共有峰之间的联络。由表4 可知，主成分1 与峰1 ～3 、6 ～8 、10 有较好的相关性，主成分2 与峰4 、9 有较好的相关性，主成分3 与峰5 有较好的相关性，因而，在PCA 中其3 个主成分能够较好地代表生白芍与酒白芍样品饮片中大部分成分的信息，故选取主成分1 ～3 进行PCA ，得其主成分得分图，成果见如图5 。由图5 可得，白芍酒炙前后样品全体可显着聚为2 类。其间B1 ～B10 为一类（未含B5 ），J1 ～J10 为一类，其成果与上述HCA 成果 共同，标明白芍酒炙前后存在必定差异。

　　2.4.3 正交偏最小二乘 - 判别剖析（ orthogonal partial least squares-discriminant analysis ， OPLS-DA ）白芍饮片酒炙前后首要差异性标志物 [15-16] 选用 SIMCA 14.1 对一切样品10 个共有峰相对峰面积为变量，进行OPLS-DA ，以确认白芍饮片酒炙前后的首要差异成分，成果见图6 、7 。如图6 所示，白芍酒炙前后样品，可显着分为2 组，生白芍B1 ～B10 与酒炙白芍J1 ～J10 各为1 组，这与PCA 成果共同；如图7 所示，峰1 （没食子酸）、2 （氧化芍药苷）、3 、7 （芍药苷）、8 （没食子酰芍药苷）的变量重要性投影（variable importance in projection ，VIP ）值大于1 ，提示以上5 种成分为白芍饮片酒炙前后的首要差异成分，且经过上述Violin Plot 可得，该5 种成分在白芍饮片酒炙前后均会产生显著性改变，即P ＜0.05 ，可作为白芍酒炙前后的差异性标志物。

　　归纳上述剖析，挑选得 5 种差异性标志物，其间可指认出4 种差异性标志物别离为没食子酸、氧化芍药苷、芍药苷、没食子酰芍药苷；而在白芍饮片中氧化芍药苷含量过低，不易精确测定，故后续选取其可指认且含量较高可精确测定的 没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷等3 种成分进行定量剖析。以期相对全面、客观地剖析白芍酒炙前后差异性标志物改变状况。

　　2.5.1 线 种成分对照品，精细称定，以“2.1.1 ”项下过程制造6 个不同质量浓度的对照品溶液。按“2.2 ”项下色谱条件检测，别离以峰面积与质量浓度为纵、横坐标进行线性回归，得回归方程别离为没食子酸Y ＝0.114 3 X ＋3.673 8 ，R2 ＝0.999 2 ，线 μg/mL ；芍药苷Y ＝0.225 6 X －0.051 7 ，R2 ＝0.999 9 ，线 μg/mL ；没食子酰芍药苷Y ＝0.048 8 X －0.027 4 ，R2 ＝0.999 6 ，线 μg/mL ；成果可得各对照品线 精细度试验 取对照品没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷质量浓度别离为50.2 、100.6 、100.4 μg/mL 的混合对照品溶液，接连进样6 次，得没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷峰面积的RSD 别离为0.790% 、0.951% 、0.503% ，标明仪器具有杰出的精细度。

　　2.5.3 安稳性试验 取生白芍饮片样品（B1 ），依照“2.1.2 ”项下办法过程制造供试品溶液，别离在0 、2 、4 、8 、12 、24 h 检测进样。其成果可得，没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷峰面积的RSD 依次为0.658% 、1.154% 、0.785% ，得其溶液在24 h 内安稳性杰出。

　　2.5.4 重复性试验 取同一批生白芍饮片样品（B1 ）6 份，依照“2.1.2 ”项下的过程办法制造供试品溶液，之后进样。其成果可得，没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷质量分数均匀值依次为0.165% 、2.844% 、0.135% ，RSD 别离为1.979% 、1.356% 、2.320% ，标明此办法具有杰出的重复性。

　　2.5. 5 加样回收率试验 取已测定3 种目标成分含量的样品（B1 ）6 份，每份约0.05 g ，精细称定，以1 ∶1 份额参加没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷对照品适量，之后进样检测，得加样回收率调查成果。成果没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷的均匀加样回收率别离为98.82% 、102.50% 、103.00% ，RSD 别离为2.94% 、2.15% 、2.08% ，可得此办法具有杰出的精确度。

　　2.5. 6 样品测定 对10 批生白芍饮片样品与10 批酒白芍饮片样品进行含量测定，依照“2.1 ”项下过程办法制造对照品溶液和供试品溶液，按“2.2 ”项下所述的色谱条件进样剖析，核算供试品溶液中3 种可指认且含量较高可精确测定的首要差异性标志物没食子酸、芍药苷、没食子酰芍药苷的含量，成果见表5 。

　　一起将测定成果导入微生信在线渠道 （） ，制作聚类热图[17] ，一起结合SPSS 24.0 软件对其进行独立样本t 查验剖析，成果见图8 ，可直观形象地调查和比照白芍饮片酒炙前后该3 种成分含量改变趋势，区别生白芍与酒炙白芍饮片的质量差异。成果显现，白芍酒炙后没食子酸含量显著性升高，芍药苷、没食子酰芍药苷含量显著性下降，该3 种成分酒炙前后出现出显着差异（P ＜0.01 ），一起经过聚类热图可将白芍酒炙前后分为两类，分类成果与HCA 成果共同，标明该3 种成分能够作为区别生白芍与酒白芍质量操控与辨别的质控目标。

　　本研讨树立了生白芍饮片与酒炙白芍饮片的HPLC 指纹图谱，经过类似度点评可得，单独生白芍饮片与酒炙白芍饮片全体质量相对安稳，但无法反映白芍酒炙前后的区别性及质量差异；后续进行共有峰差异性剖析得出白芍酒炙前后各共有峰峰面积的差异性改变，并进一步使用化学计量学等办法，剖析白芍饮片酒炙前后指纹图谱差异，经过HCA 可显着把生白芍与酒炙白芍分为2 类，其成果与PCA 成果相互印证，标明白芍酒炙前后存在必定差异，OPLS-DA 成果标明峰1 （没食子酸）、2 （氧化芍药苷）、3 、7 （芍药苷）、8 （没食子酰芍药苷）为二者质量差异的首要代表成分，且经过酒炙前后均会产生显著性改变，即P ＜0.05 ，可作为区别生白芍饮片与酒炙白芍饮片的差异性标志物。

　　其间，对白芍酒炙前后各共有峰差异改变进行剖析，发现白芍酒炙后，除峰1 （没食子酸）与峰9 （1,2,3,4,6-O- 五没食子酰葡萄糖）峰面积添加外，其他成分峰面积均出现下降趋势；结合Xiong 等[18] 选用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 对中药白芍中鞣质进行判定的报导中发现白芍中含有多种水解鞣质，可在酸、碱、酶等条件下逐渐产生水解，因而估测本试验中鞣质类成分峰1 （没食子酸）与峰9 （1,2,3,4,6-O- 五没食子酰葡萄糖）峰面积添加，其原因或许是，在酒炙过程中某一可水解类鞣质水解，使之有所添加，一起峰1 （没食子酸）添加具有显著性，或许为白芍在编造过程中，黄酒华夏有成分的引进以及部分峰9 （1,2,3,4,6-O- 五没食子酰葡萄糖）可持续水解产生峰1 （没食子酸），然后使其显著性添加。而其他成分峰面积出现下降的趋势，或许原由于在酒炙过程中，受热不安稳，使其结构遭到了损坏，然后使其响应值下降，如白芍中所含的化学成分峰7 （芍药苷）以及其类似的化合物，峰8 （没食子酰芍药苷）等，或许在炒制过程中，其高温条件下别离使其醚苷键与酯苷键开裂，而生成其他化合物[19-20] ；该些成分以及产生转化的详细机制还有待进一步验证研讨。

　　白芍所含化学成分冗杂多样 [21] ，研讨发现其所含成分芍药苷可削减炎症因子的生成，并可使正常的细胞信号传导得到康复，然后发挥抗炎的效果，一起还可经过腺苷A1 受体发挥镇痛效果，此外，芍药苷还可遏止活性氧（ reactive oxygen species ， ROS ）的生成 和NADPH 氧化酶4 （NOX4 ）的表达，并经过激活磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase ，PI3K ）/ 蛋白激酶B （protein kinase B ，Akt ）信号通路，使得核因子E2 相关因子2 （nuclearfactor- E2-relatedfactor 2 ，Nrf2 ）表达上调，然后经过抗氧化 机制缓解胆汁淤积，然后起到保肝等药理效果[22-24] ，为白芍发挥柔肝止痛成效的首要物质基础之一；所含成分没食子酰芍药苷与没食子酸，则别离可经过按捺血管内皮细胞的增殖然后按捺血栓的构成与舒张血管[25-26] ，发挥白芍养血活血等成效，一起没食子酸还可下降其肝脏中丙二醛（malondialdehyde ，MDA ）含量，进步超氧化物歧化酶（superoxide dismutase ，SOD ）生机然后具有必定的保肝效果。该3 种成分与白芍功能主治密切相关，且在白芍酒炙前后首要差异标志物中含量较高，因而，对挑选出的此3 种首要差异标志物进行定量剖析。依据含量测定成果与聚类热图可直观得出，白芍酒炙后没食子酸含量显著性升高，芍药苷与没食子酰芍药苷的含量显著性下降；3 种成分均有显著性差异改变，一起经过聚类热图仍可将白芍酒炙前后分为2 类，与化学计量学剖析成果共同，进一步证明了挑选该3 种成分作为白芍酒炙前后差异性标志物的合理性，可为后续进一步探求成效改变机理与酒炙前后质量操控供给科学参阅。

　　白芍作为大宗中药种类，酒炙是其首要的编造办法之一，创造酒温升散寒，平缓其酸寒伐肝之性，增强其养血调经、柔肝止痛等成效。现有研讨标明，生物碱和苷类成分是具有苦寒之性药物的物质基 础[22] ，而白芍中富含单萜苷类成分，结合本研讨中发现白芍酒炙后会使单萜苷类成分芍药苷、没食子酰芍药苷等成分含量下降，估测这或许与白芍酒炙后寒性下降有着必定的联络，其编造机制，有待进一步深化探求；一起没食子酸有必定的活血与保肝的效果，酒炙后其在饮片中含量升高，与白芍酒炙后养血保肝等成效的增强具有必定的相关性，其含量升高或许与没食子酸鞣质类成分在酒炙过程中水解有关。

　　本研讨关于白芍酒炙前后化学成分的剖析尚存在缺乏，暂未清晰峰3 、4 、5 所对应的化学成分，后期将选用色谱- 质谱联用等办法进一步对不知道成分进行判定；一起结合药理药效试验进一步研讨白芍酒炙前后成分改变及其成效改变的相关性。综上所述，本研讨依据指纹图谱结合化学计量学比照研讨了白芍酒炙前后的差异性，并挑选出二者差异性标志物，可为白芍酒炙前后饮片的质量操控和质量点评供给参阅，一起对二者差异性标志物进行定量剖析，对白芍酒炙前后中化学成分改变状况进行了开始探求，为白芍酒炙前后编造机制及临床使用的深化研讨供给科学依据。

　　来 源：飞，岳倩侠，孙叶芬，江栋梁，佟沫儒，金传山，张 伟，李培培，罗 云．依据指纹图谱与化学计量学的白芍酒炙前后差异性标志物研讨 [J]. 中草药, 2023, 54(8):2398-2407.